II. SPEKTROFOTOKOPI UNTUK PENENTUAN KADAR PROTEIN

A. Pendahuluan

1. Latar Belakang

Protein merupakan zat yang sangat berguna bagi kehidupan manusia. Fungsi protein yaitu untuk membangun sel tubuh baru dan mengganti sel lama yang telah rusak. Kandungan protein untuk tiap bahan makanan yang dikonsumsi besarnya berbeda-beda. Karena itu, pengukuran kadar protein suatu bahan sangat diperlukan.

Pengukuran kadar protein dengan menggunakan spektrofotometer UV – VIS. Pada dasarnya anlisis kuantitatif / kualitatif dengan spektrofotometer berprinsip kerja reaksi anata radiasi elektromagnetik dengan elektro bahar. Radiasi elekyromagntik sendiri menjadi bermanfaat karena berfungsi sebagi gelombang sekaligus sebagai materi. Sebagai gelombang, radiasi elektromagnetik mempunyai panjang gelombang tertentu yang membuatnya dapat memberikan warna yang terlihat. Sebagai materi, gelombang elektromagnetik mempunyai energi yang dapat berinteraksi dengan partikel bahan.

Apabila cahaya (radiasi elektromagnetik) mengenai suatu bahan maka energinya sebagian akn diserap molekul bahan sehingga elektro-elektronya menjadi teroksitasi ketingkat yang lebih tinggi. Besar perbedaan tingkat energi ground state dengan tingkat energi tereksitasi untuk setiap molekul tidak sama. Oleh karena itu, setiap molekul bahan akan mempunya panjang gelombang optimum yaitu panjang gelombang dimana energi yang dimiliki gelombang itu besarnya sama dengan yang dibutuhkan untuk mengeksitesi elektro-elektron bahan. Disamping itu, jumlah energi yang diserap sebanding dengan jumlah materi bahan, sehingga spektrofotokopi dapat digunakan untuk uji yang bersifat kuantitatif.

2. Tujuan Praktikum

Tujuan dari praktikum acara Spektrofotokopi untuk penentuan kadar protein ini adalah :

a. Penentuan kadar protein sampel

b. Membuat larutan sampel

c. Menentukan kadar protein larutan sampel dengan metode spektrofotokopi

d. Menentukan kadar protein sampel

3. Waktu dan Tempat Praktikum

Praktikum acara kedua ini dilaksanakan pada hari Senin, 10 November 2008, pada pukul 10.00-13.00 WIB bertempat di Laboratorium Biologi Tanah Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret Surakarta.

B. Tinjauan Pustaka

Protein pada setiap bahan kadarnya berbeda-beda. Pengukuran kadar protein suatu bahan sangat diperlukan karena erat kaitannya dengan tingkat konsumsi manusia. Pengukuran kadar protein dengan menggunakan metode Lowry adalah dasar dari penggunaan spektrofotometer. Metode ini dapat mengukur kadar protein sampai dengan 5 mikrogram. Warna biru yang terjadi oleh pereaksi Ciocalteau disebabkan reaksi antara protein dan Cu dalam larutan alkalis dan terjadi reaksi garam fosfotungstat dan garam fosfomoliddat oleh tirosin dan triptopan (Ahmad, 1997).

Protein merupakan makromolekul polipeptida yang tersusun dari sejumlah asam-asam amino yang dihubungkan oleh ikatan peptida dan mempunyai bobot molekul 5000 sampai berjuta-juta. Satu molekul protein disusun oleh sejumlah asam amino tertentu dengan susunan tertentu pula dan bersifat turunan (Aisyah , 1998).

Konsentrasi protein diukur berdasarkan atas optical dencity pada panjang gelombang tertentu untuk mengetahui banyaknya protein dalam larutan. Protein dengan garam fosfotungstat pada suasana alkalis akan memberikan warna biru yang intensitasnya tergantung pada konsentrasi protein tertera. (Arthur, 1996).

Analisa Kjeldahl dapat dipakai untuk menganalisis kadar protein dalam bahan makanan secara tidak langsung. Analisa ini dipakai untuk mengetahui kadar protein dengan menggunakan asam sulfat pekat dengan katalis selenium oksiklorida. Cara ini merupakan cara yang sederhana dan mudah dilakukan. (Basari, 1997)

Kurva standart merupakan kurva Alibrasi dari sederet larutan standart larutan-larutan itu. Larutan itu sebaiknya mempunyai komposisi cuplikan. Hasil tidak pernah didasarkan pada literature absortivitas molar. (Polling, 1996).

C.Alat, Bahan, dan Cara Kerja

1. Alat

a) Tabung Reaksi

b) Rak Tabung Reaksi

c) Pipet

d) Gelas Ukur

e) Pengaduk

f) Akuades

g) Spektrofotometer

2. Bahan

a) Reagen A ( Larutan Na₂CO₃ dalam NaOH)

b) Reagen B (Larutan CuSO₄)

c) Reagen C (Larutan K-tarstrat dalam akuades)

d) Reagen D (Campuran A:B:C=1:2:3)

e) Reagen E (Larutan Folin Ciacalteau dalam akuades)

f) Larutan standart BSA

g) Larutan Kedelai

3. Cara Kerja

1. Penentuan kadar protein sampel

a. Menghaluskan ½ gram sampel dan memberi air sampai 100 ml

b. Memasukkan 1 ml sampel ke dalam tabung reaksi

c. Menambahkan 1 ml reagen D digojok dan diamkan selama 10 menit

d. Ditambah 3 ml reagen E digojok dan diamkan selama 20 menit pada suhu ruangan

e. Diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm dengan menggunakan spektrofotometer

f. Dibuat kurva standart dengan cara memperlakukan standart BSA dengan konsentrasi 0; 0.06; 0,12; 0,18; 0,24; 0,3 mg/ml

g. Dibuat kurva regresi linier

D. Hasil dan Analisis Hasil Pengamatan

1.Hasil Pengamatan

Tabel 1.3. Pengamatan absorbansi larutan BSA

No	BSA (X)	Lart BSA (ml)	Aquades (ml)	Absorbansi (y)
1.	0	0	1,0	0,034
2.	0,06	0,2	0,8	0,095
3.	0,12	0,4	0,6	0,175
4.	0,18	0,6	0,4	0,196
5.	0,24	0,8	0,2	0,256
6.	0,3	1	0	0,292

Sumber : Laporan Sementara

Tabel 2.1. Pengamatan Absorbansi sampel X

No.	Jenis sampel (0,2 ml)	ml	X	Kadar Protein	Absorbansi (y)
1.	Jagung	1	0,13	2,6%	0,166 (Å)
2.	Kedelai	1	1,36	2,72%	1,213 (Å)

Sumber : Laporan Sementara

2.Analisis Hasil Pengamatan

a. Mencari nilai x untuk sampel

- Jagung

y = a + bx dengan a = 0,0465

b = 0,856

y = 0,0465 + 0,854x

r = 97,4%

y = a + bx

0,166 = 0,0465 + 0,856x

0,166 – 0,0465 = 0,856 . x

x = = 0,13

- Kedelai

0,166 = 0,0465 + 0,854x

x = = 1,36

b. Menentukan kadar protein sampel Jagung dan kedelai

- Jagung

Kadar protein =

1 ml jagung + 1 ml R.D + 3 ml R.E

1 ml kedelai + 1 ml R.D + 3 ml R.E

Kadar Protein

=

=

= 0,26 x 100%

= 2,6%

- Kedelai

=

=

= 0,26 x 100%

= 2,72%

E. Pembahasan dan Kesimpulan

1. Pembahasan

Spektrofotometer merupakan salah satu alat yang dapat digunakan untuk menentukan kadar protein pada suatu bahan atau sampel. Prinsip kerja yaitu reaksi antar radiasi elektromagnetik dengan partikel bahan.

Setelah sampel ditambah dengan reagen D lalu digojog dan didiamkan selama 10 menit, lalu ditambah dengan reagen E dan dibiarkan selama 20 menit, mengalami perubahan pada sampel yaitu menjadi warna biru. Warna biru ini disebabkan karena reaksi antara protein dengan Cu²⁺ dalam larutan alkalis dan terjadi reduksi garam fosfotungstat fosfomolibdat oleh tirosin dan triptopan yang ada dalam protein.

Untuk mengetahui absorbansi suatu larutan BSA, maka larutan tersebut dimasukkan dalam suatu wadah yang dapat dilalui oleh gelombang elektromagnetik dalam spektrofotometer. Panjang gelombang yang digunakan adalah 540 nm.

Untuk menghitung protein dari sampel setiap 1 gr bahan dicari dengan rumus = (1/200) . 0,2 . 1000 sedang kadar protein dalam 1 gr bahan dihitung dengan rumus = (x . 200 . 5 / 100) . 100% dan diperoleh kadar protein sampel kedelai 21,8%.

Berdasarkan hasil perhitungan kadar protein dapat dibuat kurva hubungan antara konsentrasi (x) dengan absorbansinya. Kurva ini dibuat untuk mengukur banyaknya protein dalam suatu bahan. Dari kurva dapat dilihat bahwa kadar protein akan semakin tinggi seiiring dengan semakin besarnya konsentrasinya.

2. Kesimpulan

Pada praktikum acara kedua ini dapat ditarik kesimpulan yaitu :

1. Penentuan kadar protein menurut metode Lowry Folin Ciocalteau menunjukkan jumlah protein yang terkandung dalam larutan.
2. Absorbansi dengan konsentrasi mempunyai hubungan yang berbanding lurus.
3. Kadar protein dan absorbansi mempunyai hubungan yang berbanding lurus.
4. Kadar protein jagung sebesar 2,6% dan kadar protein kedelai sebesar 2,72%.
5. Kadar protein dari bermacam sampel dapat diketahui berdasarkan kurva standart BSA dengan absorbansi larutan sampel dan dianalisa.